Para ilmuwan mengembangkan indikator kalsium tercepat untuk neuroimaging

Sensor ultra cepat baru yang dikembangkan di Janelia dapat mendeteksi ion kalsium hampir secepat dilepaskan dari neuron, memungkinkan para ilmuwan untuk membangkitkan sinyal milidetik individu yang melewati sel-sel otak.

Indikator kalsium yang dikodekan secara genetik yang disebut GCaMPs digunakan untuk melacak aktivitas kelompok besar neuron pada hewan hidup dengan mendeteksi ion kalsium yang dilepaskan ketika sinyal melewati antar neuron. Ketika mereka merasakan kalsium, indikator GCaMP menyebabkan neuron menghasilkan lampu neon hijau, memungkinkan para ilmuwan untuk melihat neuron dan sinapsis mana yang diaktifkan pada hewan hidup saat mereka melakukan tugas.

Indikator GCaMP menjadi lebih cerah dan lebih sensitif sejak pertama kali dikembangkan lebih dari 20 tahun yang lalu. Tetapi bahkan sensor kalsium terbaru tidak cukup cepat untuk mengekstraksi sinyal individual dari neuron tertentu yang sedang diaktifkan. Itu membuat para ilmuwan hanya mampu melacak kelompok neuron dan wilayah otak.

Sekarang, peneliti Janelia telah membuat beberapa versi baru dari sensor GCaMP yang dapat mengambil sinyal saraf hampir secepat kemunculannya. Sensor jGCaMP8 baru, yang sekitar 10 kali lebih cepat dari GCaMP sebelumnya, dirinci dalam sebuah penelitian yang diterbitkan 15 Maret di alam.

Kecepatan superior dari indikator jGCaMP8, digabungkan dengan sensitivitasnya yang tinggi, berarti bahwa para ilmuwan sekarang dapat memisahkan sinyal individual yang datang dari neuron tertentu, memungkinkan para peneliti untuk lebih memahami sinyal otak mana yang bekerja ketika lalat mengepakkan sayapnya, seekor tikus mengelus kumisnya, atau ikan mengepakkan siripnya. .

“Ini adalah sistem pencitraan fungsional baru, harus dalam skala waktu ini,” kata Loren Luger, mantan pemimpin grup Janelia yang sekarang menjadi peneliti di HHMI di University of California, San Diego. “Sekarang Anda dapat mulai mengajukan pertanyaan tentang bagaimana perhitungan saraf dilakukan.”

Primer pada GCaMP

Sejak tahun 2006, para ilmuwan Janelia telah bekerja untuk meningkatkan sensor GCaMP dalam upaya yang dipimpin oleh Looger, tim proyek GENIE, dan kolaborator dekat yang bekerja dengan berbagai organisme model, termasuk mantan pemimpin kelompok Karel Svoboda, pemimpin kelompok senior dan ketua ilmu saraf kognitif mekanistik Vivek Jayaraman, dan pemimpin Grup adalah Glenn Turner, dan pemimpin pertama grup, Mischa Ahrens. Proyek ini telah menghasilkan indikator yang lebih cerah dan lebih sensitif yang merupakan salah satu cara terbaik untuk mencitrakan kelompok besar neuron secara bersamaan pada hewan hidup, menurut Luger.

Namun, meskipun tolok ukur GCaMP telah meningkat dalam banyak hal selama bertahun-tahun, tolok ukur tersebut tidak jauh lebih cepat. Sementara sinyal lewat antar neuron dengan kecepatan sekitar 2 ms, indikator GCaMP akan menghasilkan sinyal yang dimulai setelah sekitar 50 ms dan bertahan sekitar 600 ms. Para ilmuwan dapat melihat bahwa sekelompok neuron diaktifkan, tetapi mereka tidak dapat memicu impuls individu yang membentuk sinyal tersebut.

Peneliti Janelia dan tim lain berusaha untuk membuat indikator GCaMP lebih cepat, tetapi peningkatan kecepatan mengorbankan sensitivitas dan kecerahan. Kemudian, enam tahun lalu, kepala ilmuwan Luger dan Janelia, Yan Zhang, memutuskan untuk mencoba lagi.

Membuat GCaMP lebih cepat

Tim memulai dengan melihat struktur khusus indikator GCaMP. Bagian pengikat kalsium mengandung protein calodulin dan peptida RS20. Setelah terikat pada kalsium, kalmodulin dan RS20 berinteraksi untuk menyebabkan perubahan bentuk protein yang menyebabkan protein fluoresen hijau yang menempel, atau GFP, bersinar lebih terang.

Interaksi antara calmodulin dan peptida ini mengontrol kecepatan sensor GCaMP. Dengan mengubah RS20 ke peptida lain, tim mengira mereka mungkin bisa mempercepat indikatornya. Mereka mencoba 30 peptida berbeda dan menemukan satu yang mempercepat sinyal GCaMP tanpa kehilangan banyak sensitivitas.

Selanjutnya, tim berusaha meningkatkan sensitivitas dengan mengganti bagian lain dari kompleks protein, yang disebut “penghubung” dan “antarmuka”. Mereka bekerja dengan tim proyek GENIE untuk menguji 1.000 mutasi berbeda pada neuron yang dikultur. Akhirnya, setelah empat tahun, mereka memiliki indikator ultrafast yang lebih sensitif dibandingkan GCaMP sebelumnya. Mereka merilis sensor mentah jGCaMP8, dengan tiga varian untuk berbagai aplikasi, pada tahun 2020.

“GCaMP sebelumnya sangat lambat untuk sepenuhnya menangkap sinyal saraf,” kata Zhang, penulis utama makalah baru ini. “jGCaMP8 memiliki waktu naik yang jauh lebih cepat dalam sinyal fluoresensinya — untuk beberapa aplikasi, waktu naik setengahnya adalah 2 ms.” Saya perhatikan bahwa berkat peningkatan kecepatan, sensor melacak perubahan konsentrasi kalsium dengan lebih akurat. “Tidak seperti upaya sebelumnya untuk mempercepat GCaMP, yang merusak sensitivitas, jGCaMP8 baru dapat menghasilkan sensitivitas yang lebih tinggi, karena mengambil banyak sinyal kalsium selama aktivitas saraf.”

Sensitivitas dan kecepatan sensor jGCaMP8 akan memungkinkan para peneliti untuk melakukan eksperimen yang tidak dapat mereka lakukan sebelumnya, kata Marton Rosa, ahli saraf di Allen Institute dan penulis utama makalah baru tersebut. Sensor sebelumnya hanya memungkinkan peneliti untuk melihat semburan aktivitas saat merekam kelompok neuron, tetapi jGCaMP8 memungkinkan mereka untuk secara akurat mendeteksi potensi aksi individu dari neuron individu pada skala yang lebih besar.

“Kami ingin memahami bagaimana otak memproses informasi, dan jika kami tidak merekam semua informasi di otak, kemungkinan besar kami akan membuat model yang salah,” kata Rosa. “Semakin banyak informasi yang kami dapatkan, semakin baik model yang dapat kami buat, dan sensor ini benar-benar mendorong kami ke arah itu.”

Luger percaya bahwa pengembangan jGCaMP8 hanya dapat terjadi di lembaga penelitian seperti Janelia, di mana laboratorium mendapat dukungan dari sumber daya bersama dan tim proyek — ditambah keahlian materi pelajaran untuk laboratorium yang bekerja pada model organisme tertentu — untuk mengambil alih jurusan. Proyek yang membutuhkan waktu, sumber daya, dan keahlian dari banyak orang yang berbeda.

“Jika laboratorium mencoba melakukannya sendiri, itu tidak mungkin, tetapi bahkan jika memungkinkan, itu akan memakan waktu lima kali lebih lama dan biaya lima kali lebih banyak,” katanya. “Dia benar-benar mengambil tempat seperti Janelia.”